拉里·戴雷一直觉得自己是个做大事的人，他一直梦想着自己有一天能做个大冒险家，成就一番事业，成为老婆和儿子心目中的大英雄。当然，这一切只是梦想，现在摆在眼前的是，他必须在圣诞节之前找到一份工作。他和妻子离婚了，如果他没有工作，儿子将被判给妻子抚养。拉里不愿让儿子失望，于是，在一番努力下终于找到了一份工作，也是唯一一份——纽约自然历史博物馆的守夜人。
夜深人静，第一次当守夜人的拉里手持特大号手电筒到自然历史博物馆上班。博物馆的老守夜人告诉拉里说他的任务就是“确保在晚上没有任何东西能进博物馆，同样也要确保没有任何东西能走出博物馆”。拉里觉得这个守夜人是老糊涂了，整个博物馆除了他之外，还有什么活物能跑出去呢?从恐龙骨架到西部牛仔的拓荒史模型再到埃及金字塔，这些历史悠久的东西摆放在整个巨大的博物馆里，拉里觉得一个人晚上在这种地方，多少还是有点心里发毛。
然而，更让他惊魂的在后头。过了半夜，拉里突然听见博物馆走廊有声响，他回头一看，一个硕大的恐龙骨架竟然活了过来，正咆哮着朝他蹦过来。躲过一劫的拉里发现除了恐龙之外，博物馆其他的东西全都复活了：画像中的猴子跑出来闲逛、三寸高的西部牛仔们绑架了拉里，把他放在模型铁轨上让火车轧、印第安勇士朝拉里投长矛……惊魂不定的拉里来不及思考为什么这些东西会动起来，他现在唯一要做的就是让这些东西恢复原状，否则他第二天肯定会被炒鱿鱼。在他绞尽脑汁想办法的时候，伟大的救星——美国历史上最聪明的总统泰迪·罗斯福——陈列在博物馆的总统骑马雕像突然也复活了。在罗斯福总统的指引下，拉里开始了自己梦想已久但首次遇到的冒险之旅，惊险之余笑料百出。拉里能让发狂的博物馆居民安定下来吗?他能保住这份来之不易的工作吗?
当然，拉里做到了，经过几个晚上的努力，拉里不仅使博物馆里秩序井然，他还抓获了企图偷走博物馆宝贝的三个坏蛋。拉里成了人们心中的大英雄，也成了儿子心中最伟大的爸爸。